Die Sammlungen zweier kunstbegeisteter Priester, die als Professoren in Freising lehrten, bildeten den Grundstock des Museums. Joachim Sighart überließ 1857 dem Priesterseminar auf dem Freisinger Domberg eine Reihe von qualitätvollen mittelalterlichen Kunstwerken. Angeregt durch das Museé Cluny in Paris entwickelte Sighardt die Idee eines Mittelaltermuseums für Christliche Kunst, das dem Klerus Anschauungsunterricht in Geschichte und Ästhetik geben sollte. Im Jahr 1864 schenkte Heinrich Gotthard dem Museum 27 zum Teil bedeutende Tafelbilder des 15. Jahrhunderts. Bis in die 60er Jahre des 20. Jahrhunderts wuchs die Sammlung auf über 1000 Objekte an. Julius Kardinal Döpfner initiierte deshalb die Errichtung eines für die Öffentlichkeit bestimmten Museums unter der Trägerschaft der Erzdiözese München und Freising.
Das Museum zeigt u.a. Werke von Erasmus Grasser, Jan Polack, Hans Leinberger, Lucas Cranach, Cosmas Damian Asam, Giandomenico Tiepolo, Heinrich Schönfeldt, Johann Baptist Straub, Ignaz Günther, Alexej Jawlensky oder Rupprecht Geiger.
